AxyPrep-96 DNA凝膠回收試劑盒

                              AxyPrep-96 DNA凝膠回收試劑盒 
本試劑盒適合從各種瓊脂糖凝膠中回收多至 8 μg 長度在 70 bp-10 kb 的片段，回收率為 60-85%。瓊脂糖凝膠在溫和的緩沖液（DE-A溶液）中熔化，其中的保護劑能防止線狀 DNA在高溫下降解，然后在 DE-B溶液的作用下使 DNA選擇性地結合到膜上。純化的 DNA純度高，并保持片段完整性和高生物活性，可直接用于連接、體外轉錄、PCR 擴增、測序、微注射等分子生物學實驗。 
 
一、試劑盒組成、貯存、穩定性 
Cat. No. AP-96-GX-1 AP-96-GX-4 AP-96-GX-24 
制備次數 1×96 prep 4×96 preps 24×96 preps 
96-well DNA plate- A 1 4 24 
96-well 2.2 ml growblock 2 8 48 
96-well V-bottom sample plate 1 4 24 
Adhesive film 3 15 75 
Silicone mat 1 4 24 
Buffer DE-A 40 ml 165 ml 2×480 ml 
Buffer DE-B 29 ml 80 ml 480 ml 
Buffer W2 concentrate 72 ml 2×72 ml 6×150 ml 
Eluent 10 ml 25 ml 110 ml 
說明書 1 1 1 
96-well DNA plate- A：96孔 DNA制備板。 
Buffer DE-A：凝膠熔化劑，含 DNA保護劑，防止 DNA在高溫下降解。室溫密閉貯存。 
Buffer DE-B：結合液（促使大于 70bp 的 DNA選擇性結合到 DNA制備膜上）。室溫密閉貯存。 
Buffer W2 concentrate：去鹽液。*使用前，必須按試劑瓶上的體積加入無水乙醇（可用 100%
乙醇或 95%乙醇），充分混合后使用。每次使用后需將瓶蓋蓋緊，以保持W2中的乙醇含量。 
Eluent：洗脫液，室溫密閉貯存。 
二、注意事項 
1. Buffer DE-A（含有β-巰基乙醇）和 Buffer DE-B含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和防護眼
鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水或生理
鹽水沖洗，必要時尋求醫療咨詢。 
2. 在步驟 1中，將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠熔化時間（線性 DNA長時間暴露在高溫條件
下易于水解），從而提高回收率。勿將含DNA 的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對DNA
造成的損傷。 
3. 在步驟 2中凝膠必須*熔化，否則將嚴重影響 DNA回收率。 
4. DNA 分子呈酸性，建議在 2.5 mM Tris-HCl，pH7.0-8.5的洗脫液中保存。 
三、實驗準備 
1. 準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭。
2. *次使用前，在 Buffer W2 concentrate中加入體積的無水乙醇。 
3. 準備 75 °C 水浴。 
4. 使用前，檢查 Buffer DE-B是否出現沉淀，若出現沉淀，應于 75 °C 溫浴加熱至沉淀*溶解并冷
卻至室溫后再使用。 
四、操作步驟 
1. 用干凈鋒利的刀片從瓊脂糖凝膠中切下含有目的 DNA 條帶的凝膠塊，用紙巾吸盡凝膠表面液 
體并切碎。計算凝膠重量，該重量作為一個凝膠體積（如 100 mg=100 μl 體積），然后依次放入 96孔 2.2 ml深孔板（試劑盒內提供）孔中。 
 * 觀察DNA條帶位置時，請盡可能縮短紫外照射時間，以減少紫外誘導突變。電泳時間可適當延長，從而使目的DNA條帶與其他DNA條帶盡可能分開，從而提高回收純度。 
 
2. 加入 3個凝膠體積的 Buffer DE-A，用硅膠片密封各孔（試劑盒內提供），混合均勻后于 75 °C溫浴，間斷混合（每 3-5 min），直至凝膠塊*熔化（15 min左右）。3,000×g 簡短離心使硅膠片上的溶液到 96深孔板中。 
* 溫浴及混勻過程中，要確保硅膠片與深孔板貼緊，以免孔間樣品污染。 
* Buffer DE-A為紅色溶液。在熔化凝膠的過程中，可以幫助觀察凝膠是否*熔化。 
 
3. 棄硅膠片。每孔加 0.5個 Buffer DE-A體積的 Buffer DE-B，用不干膠片（試劑盒內提供）密封各孔，混合均勻。3,000×g 簡短離心使不干膠片上的溶液到 96深孔板中。當分離的DNA 條帶小于
400 bp 時，應在此溶液中再加入 1個凝膠體積的異丙醇。 
* 加Buffer DE-B 后混合物顏色變為黃色，充分混勻以保證形成均一的黃色溶液。 
 
4. 將 96孔 DNA 制備板（試劑盒內提供）置于新的96孔 2.2 ml 深孔板（試劑盒內提供）上，然后將樣品轉移至 96孔 DNA制備板中，用不干膠片密封各孔，3,000×g 離心 5 min，棄濾液。 
 
5. 將 96孔 DNA 制備板置回深孔板上，每孔加800 ml Buffer W2，3,000×g 離心 1 min，棄濾液；以同樣的方法，再用 800 ml Buffer W2洗滌一次，3,000×g 離心 1 min。 
 * 確認在Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。 
* 兩次用Buffer W2沖洗能確保鹽分被*清除，消除對后續反應的影響。 
 
6. 將 96孔DNA制備板置回 96孔 2.2ml 深孔板上，3,000×g 離心 5 min。 
7. 將96孔DNA制備板置于潔凈的96孔V型底板（試劑盒內提供）上，在膜正中央加50 ml Eluent或去
離子水，用不干膠片密封各孔，室溫靜置 5 min。3,000×g 室溫離心 5 min洗脫DNA。 
* 將Eluent或去離子水加熱至65℃，可提高洗脫效率。